لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

زمینه و هدف: شناسایی آنتی ژن هایی از بروسلا که بتوانند پاسخ ایمنی پروتکتیو تولید کند بسیار مورد علاقه محققین می باشد. لذا بایستی آنتی ژن های مختلف بروسلا برای دستیابی به این اهداف مورد ارزیابی قرار بگیرد. در این مطالعه ما ژن 31 کیلودالتونی بروسلا ملی تنسیس M16 را در اشیرشیا کلی کلون و بیان نمودیم.روش کار: ژن کد کننده پروتئین غشای خارجی 31 کیلودالتونی بروسلا ملیتنسیس با پرایمرهای اختصاصی تکثیر و در حامل پلاسمیدی pJET1/2 و متعاقبا در pET28a (+) کلون شد و در هر دو پلاسمید تعیین توالی شد. القای تولید پروتئین نوترکیب با IPTG صورت گرفت. پروتئین نوترکیب با رزین نیکل جداسازی شد و خاصیت آنتی ژنیک آن با وسترن بلات و آنتی بادی پلی کلونال خرگوشی تایید شد.یافته ها: پروتئین غشای خارجی 31 کیلودالتونی بروسلا ملیتنسیس حاوی 241 اسید آمینه است که با موفقیت کلون و با تعیین توالی تایید شد. این آنتی ژن در میزبان اشریشیاکلی بیان و تخلیص شد. نتایج وسترن بلات و تعیین توالی نشان دهنده صحت تولید پروتئین نوترکیب و حفظ ساختار اپی توپی آن می باشد.نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که اشریشیاکلی میزبان بیانی خوبی جهت تولید پروتئین غشای خارجی 31 کیلودالتونی بروسلا ملیتنسیس محسوب می شود.

توکسوپلاسموزیس یک عفونت شایع بین انسان و بسیاری از گونه های حیوانات خونگرم در جهان است. پروتئینHSP 70  سیتوپلاسمی انگل نقش مهمی درویرولانت توکسوپلاسما گوندی دارد. در این مطالعه ژن HSP 70 با روش PCR از DNA تاکی زوئیت سویهRH  با پرایمر اختصاصی و جایگاه آنزیمیXba1  و Xho1 تکثیر شد. پس از تایید  PCRبا مشاهده باند 2004 bp روی ژل آگاروز قطعه DNA استخراج و در وکتورT/pTZ57R  کلون شد. سپس DNA با موفقیت در پلاسمید بیانی یو کاریوتی pcDNA3 که قادر به بیان ژن پروتئین شوک حرارتی 70 کیلو دالتونی است کلون گردید توالی ژن به دست آمده 100% با توالی ژن هدف به شماره U82281 در بانک ژن تطابق دارد.

زمینه: بروسلوز یکی از مهم ترین بیماری های زئونوز بوده که منجر به ضررهای اقتصادی فراوانی می شود. گونه بروسلا، باکتری های کوکوباسیل گرم منفی داخل سلولی هستند که قادر به تکثیر در فاگوزوم های ماکروفاژها می باشند و در بسیاری از گونه های حیوانی و انسان ها بیماری ایجاد می کنند. پیشگیری و تشخیص، هر دو لازمه ریشه کنی این بیماری می باشند. شناسایی و ارزیابی آنتی ژن های متفاوت سلول بروسلا در پیشبرد برنامه های پیشگیری و تشخیص نقش کلیدی دارند. در این تحقیق تولید و تخلیص پروتئین غشای خارجی 36 کیلو دالتونی نوترکیب (Omp2b) بروسلا آبورتوس به انجام رسید.مواد و روش ها: ژن پروتئین غشای خارجی 36 کیلو دالتونی بروسلا آبورتوس توسط آنزیم PrimeSTAR®HS DNA polymerase تقویت و در pJET1.2 کلون و ژن هدف در pET28a (+) ساب کلون شد. pET28a نوترکیب در E.coli BL21 (DE3) ترانسفورم شد. بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از 1 میلی مولار IPTG القا و پروتئین های حاصله توسط وسترن بلات بررسی شدند و Omp2b نوترکیب توسط آنتی سرم خرگوشی بروسلا ردیابی شدند.نتایج: ظهور باند قهوه ای- طلایی در جایگاه واکنش در وسترن بلات تاییدی بر کلون و بیان موفقیت آمیز بود. ما با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی، Omp2b نوترکیب را تخلیص کردیم که این روش پروتئین های ریفولد شده را بر روی ستون فراهم کرد.نتیجه گیری: Omp2b با موفقیت کلون، بیان و تخلیص شد. پروتئین های نوترکیب توسط آنتی سرم پلی کلونال شناسایی شدند که این امر صحت پروسه را تایید می کند.

هدف از این مطالعه روشن نمودن وضعیت سرواپیدمیولوژی بیماری ویروسی برنا در دو گروه محدود سی نفره افرادی بود که در استانهای تهران و مازندران یا با اسبهای به ظاهر سالم (اما بعضا مثبت از نظر سرولوژی) تماس داشتند و یا افرادی که به طور اتفاقی از بین اهداکنندگان خون به سازمان انتقال خون ایران انتخاب شدند. این پروژه به دنبال مطالعه قبلی که روی اسبهای به ظاهر سالم (اما بعضا مثبت از نظر سرولوژی) تماس داشتند (گروه "آ") و تعداد سی نمونه خون از افرادی که به طور اتفاقی از بین اهداکنندگان خون انتخاب شدند (گروه "ب") جمع آوری گردید (البته با ماده ضد انعقاد EDTA). در این پژوهش ابتدا مقدار کلی اسید ریبونوکلئیک (RNA) سلولی و ویروسی موجود در نمونه های خون محیطی (سلول های شسته شده تک یاخته ای یا مونونوکلئر) افراد داوطلب اهداکننده خون به طور جداگانه استحصال شد و رشته های اسید ریبونوکلئیک با روش "واکنش زنجیره ای پلیمراز معکوس" یا (RT-PCR) تکثیر و تبدیل گردید و بالاخره به کمک دستگاه اسپکتروفوتومتری مقدار اسید ریبونوکلئیک خالص بدست آمده ویروس برنا بر حسب نانوگرم اندازه گیری شد (رجوع به جداول 1 و 2). سپس با استفاده از مارکرهای ویژه و باندهای شاهد مثبت و منفی، باندهای پروتئینی 24 کیلو دالتونی ژنوم ویروسی برنا (در نمونه های مثبت) در ژل- آگاروز آغشته به "اتیدیوم بروماید" با تکنیک الکتروفورز پس از تابانیدن اشعه ماورا بنفش قابل رویت گردید  و آنگاه بلافاصله با دوربین عکاسی از نمونه های ژل- الکتروفورز عکسبرداری به عمل آمد (اشکال 1 و 2). نتایج بدست آمده در تست های ژل- الکتروفورز با روش "ساوترن بلات" تایید شدند. ارزیابی نتایج این مطالعه نشان داد که بالغ بر 26.66 درصد افراد گروه "آ" در سلول های تک یاخته ای خون محیطی خود دارای ژنوم ویروسی مثبت بودند. در حالیکه تنها 13.33 درصد افراد گروه "ب" (که الزاما با اسب تماس نداشته اند) واکنش مثبت نشان دادند. این اختلاف عمده (2 برابر) می تواند با نقش عامل تماس و یا مجاورت طولانی مدت افراد گروه "آ" با اسبهای به ظاهر سالم (اما مثبت از نظر سرولوژی) که در مطالعه قبلی در ایران انجام گرفت (بهمنی و همکاران در سال 1996 میلادی برابر با 1375 هجری شمسی)، رابطه معنی داری داشته باشد. بررسی های بیشتر روی نمونه های سرم خون افراد گروه "آ"  و گروه "ب" با روش "ساوترن بلات" نشان داد که بالغ بر 23.33 درصد افراد گروه "آ" در سرم خون خود دارای پادتن های ضد پروتئینی 24 کیلو دالتونی ویروس برنا بودند در حالیکه این نسبت در افراد گروه "ب" فقط 6.66 درصد بود. شایان ذکر است که میزان درصد پادتن ضد پروتئینی چهل کیلو دالتونی ویروس برنا در افراد گروه "آ" بالغ بر 46% بود در حالیکه این نسبت در افراد گروه "ب" فقط 6.66% بود (جداول شماره 1 و 2).

سابقه و هدف: پروتئین های شوک گرمایی Heat Shock Proteins) یا به اختصار (HSPs به عنوان Chaperone های مولکولی عمل کرده و از طریق تنظیم تا خوردگی و انتقال درون سلولی پروتئین های تازه سنتز شده، سلول را در مقابل صدمات ناشی از استرس های محیطی، محافظت می کنند. این مطالعه با هدف مشخص کردن ژن HSP60 در درماتوفیت پاتوژن میکروسپوروم کانیس انجام شد.مواد و روش ها: نمونه قارچ میکروسپوروم کانیس از بیماران مبتلا به درماتوفیتوزیس جمع آوری گردیده و در شرایط مناسب کشت داده شد. DNA با وزن مولکولی سنگین که از توده میسلیومی به دست آمد، با روش های استاندارد جدا شد. جفت پرایمرهایی با 21 نوکلئوتید از نواحی حفاظت شده (highly conserved) از ژن های HSP60 سایر سلول های یوکاریوت، طراحی شد. پرایمرهای ذکر شده به وسیله DNA ژنومی (template) جدا شده از میکروسپوروم کانیس در PCR مورد استفاده قرار گرفت. مولکول های پیش بینی شده، تقویت شدند و برای تعیین سکانس فرستاده شدند.یافته ها: توالی نوکلئوتیدی ژن HSP60 به دست آمده شامل 1550 نوکلئوتید است که پروتئینی با 497 آمینواسید را رمز می نماید.نتیجه گیری: در مطالعه حاضر، ما هویت و خصوصیت مولکولی یک ژن از میکروسپوروم کنیس که کد کننده یک پروتئین متعلق به خانواده پروتئین شوک حرارتی 60 کیلو دالتونی ملقب به McHSP60 می باشد را بررسی کرده ایم. آنالیز سکانس آمینواسیدی این ژن شباهت قابل توجهی با HSP60 سایر یوکاریوت ها نشان می دهد، چنان که بیش از %97 با C. immitis، %92 با Aspergillus fumigatus و %74 با S. cerevisiae همولوژی دارد. تجزیه و تحلیل ترکیب آمینواسیدی در HSP60 بیانگر غنی بودن آن از آلانین، گلوتامیک اسید و گلایسین است. ترکیب آمینواسیدی McHSP60 نشان دهنده ناچیز بودن مقدار سیستئین و تریپتوفان در آن می باشد.

مقدمه و هدف: بروسلا یک باکتری داخل سلولی اختیاری است که عامل بیماری بروسلوز بوده و می تواند در انسان و دام ها ایجاد عفونت نماید. سویه های تضعیف شده این باکتری نظیر بروسلا ملیتنسیس سویه Rev1 و بروسلا آبورتوس سویه های S19 و Rb51 هم اکنون به منظور پیشگیری از بروسلوز در دام ها مورد استفاده قرار می گیرند، اما تا کنون واکسن مناسبی علیه بروسلا برای انسان شناخته نشده است. هدف از این تحقیق تعیین میزان ایمنی زایی واکسن ژنی دو گانه حامل؛ ژن های پلاسمید نوترکیب حامل ژن های مسوول سنتز پروتئین متصل شونده به پریپلاسم و پروتئین 31 کیلو دالتونی لایه خارجی بروسلا ملیتنسیس در موش های بالب ـ سی بود.مواد و روش ها: این پژوهش یک مطالعه تجربی است که بر روی 24 موش بالب ـ سی در تابستان سال 1386 در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، انجام گرفته است. به این منظور ابتدا با کلون سازی ژن های مسوول سنتز آنتی ژن های مذکور، پلاسمید نوترکیب به عنوان واکسن ژنی تهیه گردید و سپس، مقدار 100 میکروگرم از آن در حجم 50 میکرولیتر به عضله ران 12 سر موش بالب ـ سی تزریق گردید و از 12 موش بالب ـ سی دیگر نیز به عنوان گروه شاهد استفاده شد که به آنها به صورت مشابه بافر فسفاته نمکی تزریق گردید. این تزریقات در طی 4 مرحله یعنی در روزهایی به فاصله 1، 7، 15 و 30 انجام شد و میزان پاسخ ایمنی حاصل علیه بروسلوز به روش الیزا بررسی گردید. برای آنالیز داده ها از آزمون تی و نرم افزار SPSS استفاده گردید.یافته ها: تزریقات عضلانی این واکسن ژنی دوگانه موجب بروز ایمنی سلولی در موش های بالب ـ سی گردیده و نتایج اندازه گیری میزان سایتوکاین ها از طریق الیزا، نشان دهنده افزایش سطح اینترفرون گاما و تغییرات کم سطح اینترلوکین ـ 4 در موش های واکسینه شده در مقایسه با گروه شاهد می باشد (p<0.05).نتیجه گیری: کاربرد توام دو آنتی ژن پروتئین متصل شونده به پریپلاسم و پروتئین 31 کیلو دالتونی لایه خارجی بروسلا، قادر به ایجاد ایمنی حفاظتی بالایی علیه بروسلوز می باشد که استفاده از فیوژن پروتئین نوترکیب حاصل از بیان این ژن ها نیز می تواند در راستای بررسی ایمنی زایی علیه بروسلا در تحقیقات آینده مد نظر قرار گیرد.

سابقه و هدف: غضروف کوسه یکی از مکمل های دارویی در حذف تومور بیماران سرطانی است. البته در مورد اثر فراکشن 100 کیلو دالتونی آن بر سیستم ایمنی گزارشی اعلام نگردیده است. هدف این مطالعه، بررسی تاثیر این فراکشن بر رده سلولی سرطانی K562 و لنفوسیت های خون محیطی طبیعی انسان می باشد.روش بررسی: در این تحقیق تجربی، جهت تخلیص پروتئین 100 کیلو دالتونی غضروف کوسه ماهی از روش تخلیص کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون استفاده گردید. رده سلول سرطانی و لنفوسیت های خون محیطی طبیعی در محیط (RPMI1610 (Sigma بعلاوه 10% سرم جنین گاوی، گلوتامین، پنی سیلین - استرپتومایسین در دمای 37 درجه بمدت 2روز کشت داده شد. سلول های تک هسته ای طبیعی خون محیطی بوسیله فایکول جمع آوری گردیدند. توان حیاتی سلول ها با روش آزمون توان حیاتی (MTT) ارزیابی شد.یافته ها: در روش MTT، سرکوب سلول های سرطانی K562 در غلظت های 15mg به طور معنی داری نسبت به گروه های کنترل بیشتر بود (01/0>P).نتیجه گیری: در این بررسی برای اولین بار القای مرگ سلولی پروتئین 100 کیلو دالتونی غضروف کوسه ماهی بر رده سلولی سرطانی K562 در محیط خارج از بدن (in vitro) مشخص گردید.

آنزیم های کیتینولیتیک در تجزیه پسماندهای کیتینی نظیر پوسته سخت پوستان و دیواره سلولی قارچ ها و تولید الیگوساکاریدها از کیتین نقش دارند. خصوصیات کاتالیتیک آنها، این آنزیم ها را هدف مناسبی جهت استفاده درصنعت یا به عنوان بیوکنترل قرار داده است. در این مطالعه جهت تکثیر و همسانه سازی ژن chit 36 از جدایه بومی ایران Trichoderma atroviride PTCC 5220، آغازگرهای اختصاصی (chit36pf/chi36r) طراحی و پس از تکثیر قطعه مورد نظر، به منظور تولید پری پلاسمی در وکتور (+) pEt26b همسانه سازی و جهت بیان به باکتری E. coli BL21 -DE3 انتقال داده شد. در بررسی نتایج حاصل از SDS-PAGE هیچگونه باندی دال بر بیان پروتئین در هیچکدام از شرایط دمایی و میزان متفاوت IPTG در بخش های متفاوت سلولی مشاهده نشد. لذا در ادامه، بیان پروتئین Chit36 با حذف پپتید نشانه pelB (جهت تولید به صورت سیتوپلاسمی) همراه با توالی هیستیدین در انتهای کربوکسیلی دردستور کار قرارگرفت. باکتری حاوی سازه نوترکیب تحت شرایط القایی متفاوت مورد بررسی قرار گرفت. علیرغم عدم مشاهده هیچگونه باندی در هیچکدام از شرایط القایی با روش SDS-PAGE، بیان اندک پروتئین در 2 کلنی با استفاده از روش Western blot مورد تایید قرار گرفت. به منظور بهینه سازی شرایط بیان، میزان بیان پروتئین نوترکیب نسبت به پروتئین تام باکتری درشرایط متفاوت القایی، به روش سنجش کمی باند های پروتئینی روی ژل SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصله نشان داد که بهترین شرایط بیان در زمان القا OD600 : 0.3 و میزان IPTG یک میلی مولار و زمان انکوباسیون 6 ساعت می باشد، دراین شرایط میزان بیان پروتئین نوترکیب نسبت به پروتئین تام برابر 45.57 درصد می باشد.

ویژگی های مولکولی باکتری Yersinia ruckeri شامل پروتئین سلول کامل، پروتئین های غشای خارجی و لیپوپلی ساکاریدی تعداد 34 ایزوله باکتری از مزارع قزل-آلای استان های تهران، مازندران و زنجان با روش SDS-PAGE انجام شد. الگوی باندها برای پروتئین کل، پروتئین غشای خارجی و لیپوپلی ساکارید تمامی جدایه ها مشابه بود، به طوری که وزن مولکولی پروتئین کل برای تمام جدایه ها اغلب کمتر از 100 کیلو دالتون و تراکم باندها در دامنه وزنی 100- 28 کیلو دالتون بود. بعلاوه، الگوی پروتئین های اصلی غشای خارجی تمام جدایه ها شامل دو باند با فاصله 35-28 کیلو دالتون و یک باند با فاصله 10-17 کیلودالتون بود ونیز باندهای فرعی با 75-48 و 28-17 کیلو دالتون بود. همچنین الگوی لیپوپلی-ساکاریدی برای همه جدایه ها از وزن مولکولی کمتر از 130 کیلو دالتون با بیشترین تراکم باندی در دامنه 28-100 کیلو دالتون قرار داشت. بر اساس این مطالعه، جدایه های ایرانی از کمترین تنوع هتروژنیسیتی برخوردارند که زمینه را برای ساخت واکسن تک ظرفیتی مورد نیاز فراهم می آورد.